摘要：在構建玉米蔗糖非酵解型蛋白激酶2(SnRK2)基因家族表達載體的過程中,因為表達載體可供選擇的多克隆位點較少,且有些還與目的基因同源,所以采用轉移PCR(T-PCR)擴增技術替代通常的酶切連接方法。為避免錯誤連接或未連接的第一輪T-PCR中間產物對退火溫度不同的第二輪擴增循環(huán)產生干擾,本研究對T-PCR接頭引物3′-端和5′-端的兩段序列及其退火溫度、引物、供體質粒和目標質粒模板的濃度,特別是溫度循環(huán)程序進行設計和篩選,并用擴增構建的重組載體轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞,篩選陽性克隆,進行菌液PCR和測序驗證。結果表明,在兩條引物3′-端序列理論退火溫度相差不大的情況下,T-PCR第一輪擴增的退火溫度以低于或接近其中較低的理論退火溫度為宜。但在兩條引物3′-端序列理論退火溫度相差較大的情況下,則應高于其中較低的理論退火溫度。T-PCR第二輪擴增的退火溫度,適當低于兩條引物理論退火溫度的平均值。按優(yōu)化的溫度循環(huán)程序,從供體質粒pMD19-T擴增ZmSnRK2基因家族8個成員的編碼序列,并整合到目標載體pHBT95啟動子下游特異位點,重組率達60%以上。綜上表明,T-PCR對沒有適用多克隆位點的載體構建的實用性較強。本研究通過優(yōu)化的溫度循環(huán)程序為表達或誘變載體構建提供了一定的理論參考。